Objectif
Une entreprise nord-américaine de transformation de légumes souhaitait déterminer si INNEO pouvait être appliqué directement sur des légumes surgelés et continuer à offrir une protection antimicrobienne une fois les produits décongelés et conservés dans des conditions de stockage réfrigérées non conformes. L’objectif de l’étude était de déterminer si INNEO pouvait réduire la charge pathogène initiale, puis retarder la croissance de Listeria monocytogenes pendant le stockage réfrigéré et satisfaire à l’exigence du test de provocation de Santé Canada visant à limiter la croissance des agents pathogènes à un maximum de +0,5 Log UFC/g pendant sept jours de stockage.
Ce scénario reflète une préoccupation opérationnelle courante : les produits quittent l’usine à l’état congelé, mais ils ne restent pas congelés tout au long de la distribution ou dans les conditions de vente au détail. Une fois décongelés, les légumes peuvent favoriser la croissance de Listeria, en particulier lorsqu’ils sont exposés à des températures proches de 7 °C.
Méthodes
Micro-organismes ciblés : chaque groupe sera inoculé avec un cocktail composé de trois souches de Listeria monocytogenes spécifiques aux légumes. Ce cocktail comprend une souche isolée lors d’une épidémie de listériose (souche 108) et une souche isolée dans des aliments de ce type. Il comprend trois sérotypes différents (1/2a, 1/2b et 4b).
Répartition des lots : L’expérience est divisée en quatre groupes ; chaque échantillon de 25 g ± 0,5 g est analysé en triple à chaque moment de l’étude. Le groupe 1 est le témoin négatif (l’aliment non modifié). Le groupe 2 est le témoin positif (aliment inoculé avec 1 000 ufc/g de Listeria monocytogenes). Le groupe 3 est inoculé au même niveau que le groupe 2 mais a été préalablement traité avec Inneo en usine, et le groupe 4 est identique au groupe 3, mais a été préalablement pulvérisé avec INNEO en laboratoire.
Préparation des aliments : Les aliments seront pesés et répartis dans des récipients stériles. La contamination se produisant à la surface des aliments, les échantillons seront inoculés et traités en surface. Les aliments doivent être conservés congelés en permanence ; les échantillons sont donc conservés à -15 °C pendant le stockage et sur de la glace pendant la durée de l’expérience. La température sera surveillée à l’aide d’un thermomètre infrarouge et les échantillons ne seront pas décongelés à une température supérieure à -5 °C.
Inoculation : les souches sont cultivées en aérobiose dans du milieu TSBYE à 37 °C pendant 24 heures, puis repiquées à une concentration de 1 % dans les mêmes conditions pendant 18 heures. Chaque souche du groupe est ensuite diluée pour atteindre une concentration de 10⁸ ufc/ml dans une solution saline à 0,85 %. Elles sont acclimatées au froid à 4 °C pendant 48 h à une semaine avant d’être utilisées dans l’expérience. 24 h avant l’expérience, les souches sont dénombrées et diluées à 100 000 ufc/ml. Toutes les souches sont ensuite regroupées pour former le cocktail d’inoculation. Le jour de l’expérience, 150 μl sont répartis uniformément à la surface des aliments des groupes 2, 3 et 4 pour un inoculum de 1 Log par gramme d’aliment, ou 3 Log par gramme d’aliment.
Traitement à l’INNEO (A2-Labo) : les aliments seront préalablement pulvérisés en usine conformément aux instructions du fabricant pour le groupe 3. Pour le groupe 4, 1 ml d’Inneo sera pulvérisé à la surface des échantillons. Les échantillons seront mélangés uniformément à la main pendant 7 secondes et laissés au repos pendant 10 minutes avant l’inoculation.
Conditions de stockage : Après l’inoculation, les échantillons seront décongelés à 7 °C et conservés à 7 °C pendant 12 jours.
Plan d’échantillonnage : Chaque aliment est analysé le jour de l’inoculation/du traitement (J0 = 4 h), puis aux jours 2, 7, 10 et 12 suivant l’inoculation.
Méthode de dénombrement : MFLP-74 – Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments, tirée du Compendium des méthodes d’analyse, volume 3, de Santé Canada. Le PALCAM est utilisé comme milieu de culture.
Critères de performance : Les antimicrobiens ne doivent pas permettre au pathogène de se développer à un taux supérieur à 0,5 Log ufc/g.
Méthode d’analyse statistique : les graphiques ont été réalisés à l’aide du logiciel JMP 10.0.0 et l’analyse statistique a été effectuée en comparant les lots entre eux pour chaque jour séparément à l’aide d’une ANOVA et en utilisant le test « t de Student » pour comparer les moyennes. Les valeurs p sur les graphiques n’indiquent que les différences de l’antimicrobien par rapport au témoin positif. Les valeurs p < 0,0001 sont représentées par ****, les valeurs p < 0,001 par ***, les valeurs p < 0,01 par ** et les valeurs p < 0,05 par *. Les groupes statistiques sont également présentés. Les groupes associés à la même lettre ne présentent pas de différence significative les uns par rapport aux autres avec une valeur p < 0,0001. Cela signifie que les groupes associés à des lettres différentes sont différents les uns des autres.
Discussion
Les données montrent que l’application d’INNEO directement sur des légumes surgelés peut induire un effet antimicrobien avant même que la décongélation n’ait lieu. Bien que les réductions initiales de Listeria monocytogenesaient été modestes (0,2 à 0,6 Log selon la matrice), elles ont été obtenues sur un substrat entièrement congelé, où la létalité est généralement limitée. Plus important encore, une fois les produits décongelés et conservés à 7 °C, Inneo a retardé la croissance des agents pathogènes pendant au moins sept jours et a systématiquement maintenu les augmentations en dessous du seuil réglementaire de +0,5 Log UFC/g. Cette performance a été observée sur deux types de légumes, deux niveaux d’inoculum et deux formats d’application, indiquant que l’utilisation en amont peut encore assurer une protection en aval pendant l’exposition au froid.
L’augmentation finale des teneurs après 10 à 12 jours a coïncidé avec une détérioration visible des légumes, suggérant une altération et une perte d’intégrité du produit plutôt qu’un échec de l’antimicrobien. Cela renforce la pertinence commerciale d’une fenêtre de protection de sept jours, qui correspond aux délais habituels de distribution, de stockage et de manutention en magasin des produits végétaux décongelés. Cette approche ne nécessite aucune modification de la formulation ni aucune incidence sur l’étiquetage, fonctionne comme une intervention de surface et suit une méthode d’analyse reconnue, ce qui justifie son utilisation dans les dossiers de validation et les programmes de contrôle préventif.
Conclusion
INNEO a démontré une efficacité létale mesurable dès l’application et a efficacement limité la croissance de Listeria monocytogenes à +0,5 Log UFC/g pendant sept jours à 7 °C, répondant ainsi au critère de l’essai de provocation de Santé Canada. Pour les transformateurs chargés de gérer le risque lié à Listeria dans les chaînes d’approvisionnement allant de la congélation à la réfrigération, ces résultats confirment qu’INNEO constitue une option antimicrobienne pratique, sans incidence sur l’étiquetage, qui peut être intégrée sans perturbation dans les processus de production existants, apportant ainsi une protection significative pendant la phase de distribution la plus risquée.
